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大豆抗原蛋白的生物学特性及其对仔猪的过敏反应

大豆含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸,是人和畜禽优质的植物性蛋白源(Hancock等,2000;Friedman和Brandon,2001)。但大豆中含有的多种抗营养因子因干扰营养物质的消化吸收、破坏正常的新陈代谢和引起不良的生理反应而危害着畜禽(尤其是幼龄畜禽)的健康,因此在很大程度上降低了大豆制品的利用效率。 

大豆抗原作为大豆中的主要抗营养因子之一,是大豆中能引起畜禽过敏反应的一类蛋白质,其主要包括:大豆疏水蛋白、大豆壳蛋白、大豆抑制蛋白、大豆空泡蛋白、大豆球蛋白(glycinin)和β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)等。自Duke(1934)首次发现大豆蛋白可引起婴儿腹泻、虚脱和肠道炎症反应以来,人们对大豆蛋白的研究从未间断,现已从婴幼儿、仔猪和犊牛对大豆蛋白的过敏反应现象逐渐深入到大豆抗原蛋白的致过敏机理研究。本文从大豆抗原蛋白的生物学特性、对仔猪的影响、致敏机理以及加工对其免疫活性的影响等多个方面对大豆抗原蛋白的研究现状和进展进行简要的综述。 

1 大豆抗原蛋白的种类、结构及其生物学特性 

大豆中的抗原蛋白有很多,目前已被确认的有21种(Wilson等,2005)。根据以蛋白质沉降系数为基础的超速离心分类法,大豆蛋白分为4个组分,即2S、7S、11S和15S。其中11S组分为大豆球蛋白,占大豆可浸出蛋白总量的33%;15S组分为多聚体glycinin,占大豆可浸出蛋白总量的10%;2S组分占大豆可浸出蛋白总量的20%,主要包括胰蛋白酶抑制因子和细胞色素;其余部分为7S组分,主要含大豆伴球蛋白(conglycinin)、α-淀粉酶、脂肪氧化酶和凝集素(赵威祺,2003)。Catsimpoolas和Ekenstam(1969)用免疫电泳法将conglycinin分离并鉴定为α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin三种大豆伴球蛋白。目前研究较多的大豆抗原主要有大豆glycinin和β-conglycinin两种球蛋白。 

1.1 Glycinin 

大豆glycinin(11S)是大豆中的一种主要贮藏蛋白,也是大豆蛋白中最大的单体成分,占大豆籽实总蛋白的19.5%~23.1%(Mujoo等,2003)和总球蛋白的40.0%(李德发,2003)。Glycinin是相对分子量为320~360 kDa的六聚体,其单聚体亚基的结构形式为A-S-S-B。其中A为酸性多肽,B为碱性多肽,A和B的分子量分别为34~44 kDa和20 kDa。S-S是一个二硫键,它将A和B连接起来,分别标示为A1aB2、A1bB1b、A2B1a、A3B4和A5B3等(Maruyama等,1998)。Glycinin在构型上为两个环状六角形结构,每个环上含6个亚基,分别以酸性和碱性亚基形式交互形成稳定结构,12个亚基组成了两个相同的六角形结构,形成中空的扁圆柱。两个六角形间的结合由静电或氢键作用维系。六角环内是亚基之间的相互作用,酸性亚基和碱性亚基交互排列,各酸性亚基之间和碱性亚基之间均具有很高的同源性(Staswick 等,1981)。 

Glycinin酸性亚基和碱性亚基的等电点分别为4.80~5.50和6.50~8.50。Glycinin含有较多的含硫氨基酸,一些化学试剂(如尿素、强酸、强碱、十二磺基硫酸钠、巯基乙醇、硫化钠和亚硒酸钠等)可打断其二硫键,从而改变glycinin的四级结构,并增加其溶解度(Awazuhara等,2002)。温度对glycinin的结构和溶解性也有较大影响,冷冻干燥和低温贮存将降低glycinin的溶解度,而加热则增加其黏度,形成预凝胶,并在冷却后形成凝胶。Glycinin溶液在低温贮存时还会发生二硫键聚合现象,形成不溶的沉淀或大小不同(14~22S)的聚合体(周瑞宝和周兵,1998)。 

1.2 β-conglycinin 

β-conglycinin也是大豆中的一种主要贮藏蛋白,占大豆籽实总蛋白的10.0%~12.7%和总球蛋白的30.0%(Mujoo等,2003)。不过,β-conglycinin比glycinin含有更多的糖基(3.8%甘露糖和1.2%氨基葡萄糖)。因此,β-conglycinin是一类糖基化蛋白质(张雪梅和郭顺堂,2003)。Catsimpoolas和Ekenstam(1969)用免疫电泳方法将conglycinin分为α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin,其中α-conglycinin是具有酶活性的2S蛋白质组分;β-conglycinin和γ-conglycinin则不具有酶的活性,在中性环境和离子强度为0.05~0.10的条件下,可将β-conglycinin和γ-conglycinin分开。β-conglycinin由α、α’和β三种亚基组成,三种亚基的分子量分别为58~77、58~83和42~53 kDa(Thanh和Shibasaki,1977;Maruyama等,2003;Mujoo等,2003)。α、α’和β亚基的等电点分别为4.90、5.18和5.66~6.00(Lei和Reeck,1987)。在β-conglycinin空间结构中,α-螺旋、β-折叠和不规则结构分别占5%、35%和60%。β-conglycinin的稳定性比glycinin差,其在离子强度变化时不稳定,常发生聚合或离析作用。在高离子强度下,β-conglycinin存在一个7S沉降系数;在低离子强度下,β-conglycinin可聚合成9~10S蛋白。盐可促进β-conglycinin凝胶的形成。除Na2CO3外,所有的水合盐均可增加β-conglycinin的热稳定性。β-conglycinin的三个亚基都富含天冬氨酸/天门冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸,其中α和α’亚基的氨基酸组成非常相似,二者均含有少量的蛋氨酸但缺乏胱氨酸,而β亚基则不含蛋氨酸。三个亚基的热稳定性顺序为:β>α’>α(Maruyama等,2003)。 

作为大豆的主要球蛋白,glycinin和β-conglycinin提供了大豆食品和饲料中总蛋白65%~80%的蛋白质(Thanh等,1976;sission等,1982)。但是,glycinin、α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin都具有免疫原性,都能不同程度地导致仔猪的过敏反应,尤其以glycinin和β-conglycinin的免疫原性最强。不过,导致过敏反应的具有抗原活性的大豆glycinin和β-conglycinin只占其中很少一部分。大豆制品中究竟有多少glycinin和β-conglycinin具有抗原活性,实际上与其加工工艺密切相关。 

2 大豆抗原蛋白对仔猪的影响 

大量的研究发现,包括大豆蛋白在内的日粮抗原过敏反应是造成仔猪肠道功能变化的主要原因,且与腹泻的发生有着密切的关系。Glycinin和β-conglycinin作为大豆中的两种最重要的抗原蛋白,主要引起仔猪的过敏反应。当仔猪采食含大豆蛋白的日粮后,大部分Glycinin和β-conglycinin被降解为肽和氨基酸。由于仔猪肠道发育不成熟,少部分glycinin和β-conglycinin穿过小肠上皮细胞间或上皮细胞内的空隙完整地进入血液和淋巴,刺激肠道免疫组织,产生包括特异性抗原抗体反应和T淋巴细胞介导的迟发性过敏反应,前者刺激肥大细胞释放组胺,引起上皮细胞通透性增加和黏膜水肿,后者主要引起肠道形态变化,并表现为:小肠绒毛萎缩、脱落,隐窝细胞增生(Li等,1990),血清中大豆抗原特异性抗体滴度升高(Li,1991),结果导致消化吸收障碍、生长受阻和过敏性腹泻的发生。 

2.1 大豆抗原蛋白对仔猪免疫系统的影响 

仔猪采食日粮抗原后,大部分蛋白质和碳水化合物等大分子物质在消化酶的作用下被消化成没有抗原性的小分子物质,但仍有一小部分以完整的大分子形式通过肠上皮细胞间的空隙进入血液和淋巴,这些具有抗原活性的大分子物质刺激机体产生分泌型IgA (Swarbrick,1979)、血清IgA(Kilshaw和Sissons,1979)及血清IgE(Barratt等,1978)。分泌型IgA在机体对日粮抗原的免疫耐受性和免疫排斥中起主要作用。血清IgA能和吸收的抗原特异性结合形成IgA-抗原复合物,这种复合物很快被肝胆系统清除(Russel等,1982)。血清IgE和IgM能中和被吸收进血液中的抗原,中和后形成的抗原抗体复合物,引起机体免疫损伤,其中IgE是日粮抗原引起免疫损伤的主要抗体。IgE具有亲细胞性,其Fc片段与组织中肥大细胞上的Fc受体结合,从而使机体处于致敏状态。当日粮抗原再次进入机体后,抗原与结合在肥大细胞上的IgE结合,使肥大细胞释放组胺等细胞介质,释放的速度在结合后的15 min达到高峰,释放的时间可持续1 h(Stokes等,1986)。从而引起血浆蛋白质漏入肠腔、肠黏膜水肿、杯状细胞黏液渗出及肠道对水和电解质吸收不良。 

2.2 大豆抗原蛋白对仔猪肠道形态的影响 
断奶仔猪对大豆抗原蛋白的过敏反应包括特异性抗原抗体反应和T淋巴细胞介导的迟发型过敏反应两个方面,它们在肠道功能异常中所起的作用是不一样的,前者刺激肥大细胞释放组胺,引起上皮细胞通透性增加和黏膜水肿,而后者主要引起肠道形态的变化。已有的研究结果表明,在glycinin和β-conglycinin引起的断奶仔猪的过敏反应中,T淋巴细胞介导的迟发型过敏反应引起的肠道形态变化是主要方面。Li等(1990)报道,给7日龄的仔猪灌服大豆蛋白提取液,每天6 g,连续5 d,21日龄断奶后喂以含有相应大豆蛋白的断奶日粮,在血清中测出了较高效价的抗glycinin和β-conglycinin的抗体;断奶后第7 d测得的绒毛高度显著低于饲喂牛乳的对照组,隐窝深度和绒毛宽度显著低于对照组;用电镜对绒毛发育的观察表明,与饲喂牛乳的对照组仔猪相比,饲喂大豆蛋白的仔猪刷状缘上皮细胞不完整,且有细胞融合的现象。连续饲喂6 d后,皮下注射1:1的glycinin和β-conglycinin均匀混合物,皮褶厚度显著增加,这些变化与绒毛结构的变化一致,并与生产性能有较大的相关性。 

2.3 大豆抗原蛋白对仔猪生产性能的影响 

Dréau等(1993)给21日龄断奶仔猪饲喂大豆抗原后发现,与对照组相比,饲喂大豆抗原的仔猪体重降低了10.0%(P<0.01),绒毛面积减少了37.0%(P< 0.01),但隐窝深度无明显变化;与形态学变化相一致,黏膜上皮总淋巴细胞密度增加了31.6%(P<0.001);小肠发生炎性反应,黏膜上皮噬酸性细胞密度增加了10倍(P<0.001)。Li等(1991)通过组织学检查、木糖吸收试验和生产性能分析,研究了断奶仔猪肠道损伤和吸收受阻与生产性能下降的关系。结果表明,大豆抗原引起的肠道损伤导致了肠道吸收功能的障碍,使仔猪对营养物质的消化吸收率降低,进而导致生产性能下降。 

2.4 大豆抗原蛋白与仔猪断奶后腹泻 

在早期的研究中,人们认为断奶仔猪腹泻是由于大肠杆菌性肠炎引起的,但后来的研究发现,仔猪断奶后出现腹泻虽然与大肠杆菌有着密切关系,但大肠杆菌本身并不能单独引起这种疾病(Miller等,1984),且健康仔猪的胃肠道中存在着大量的病原性大肠杆菌。仔猪对断奶日粮中包括glycinin和β-conglycinin在内的抗原蛋白的短暂过敏反应引起的肠道损伤是断奶后腹泻的原发性原因,大肠杆菌在肠道的附着和增殖只不过是继发性原因(Miller等,1984;Li 等,1990)。 
仔猪断奶后腹泻的直接原因是养分消化率的下降,而根本原因是机体对日粮抗原发生的过敏反应,这一理论已被许多试验所证实。Kenworthy等(1976)报道,仔猪断奶后前几天发生的腹泻,典型的损伤是肠绒毛严重萎缩,酶水平下降,养分吸收率下降,但微生物检查并未发现大肠杆菌的增殖。Stokes(1986)对未断奶仔猪用卵清白蛋白诱发免疫反应时,仔猪肠道产生类似的损伤性变化。仔猪断奶前适当地补饲少量抗原可以刺激机体发生免疫反应,但再次接触该抗原时仔猪会经历二次免疫,导致更加严重的腹泻和吸收障碍。据此,他们提出日粮抗原的过敏原性是断奶后腹泻发生的关键。谯仕彦和李德发(1996)的研究表明,仔猪断奶后第8 d肠道中致病性大肠杆菌与血清抗大豆glycinin和β-conglycinin抗体效价成正比。不过,也有试验研究表明,动物在断奶前食入一定量的断奶日粮,断奶后并没有腹泻发生(Newby,1979),其原因可能是仔猪对日粮抗原产生了免疫耐受。  

3 大豆抗原蛋白的致过敏作用机理 

自Duke等(1934)首次注意到大豆抗原蛋白对婴儿的反应原性后,人们对这种过敏反应现象和可能的作用机理进行了长期的探索。日粮抗原导致的过敏反应既有特异性抗原抗体间的Ⅰ型过敏反应,又有由特异性T淋巴细胞介导的Ⅳ型过敏反应。在不同的日粮抗原所引起的过敏反应中,这两种反应的程度不同。常规处理下,大豆中的主要抗营养因子可被降低至无害水平,但大豆中的致敏因子的活性却基本不受影响。 
动物因其种类、品种及所处的环境不同,对大豆抗原蛋白过敏的反应也不同,但其机制基本相似。肠道对抗原蛋白吸收增加是引起过敏反应的决定性因素(Walker-smith,1986),而特异性免疫力不足是抗原蛋白大量透过肠道进入血液循环的主要原因。动物饲喂一种新的日粮,将产生针对该日粮中抗原的相应抗体(谯仕彦和李德发,1995),如分泌型IgA,血清型IgA、IgE、IgM和IgG。从肠道吸收的抗原在血液中和相应的抗体结合形成抗原-抗体复合物。分泌型IgA在肠道内可直接中和日粮抗原,从而阻止抗原被小肠吸收。血清型IgA与循环中的日粮抗原形成的复合物相对缺乏免疫药理作用(王彩虹等,1997),可很快被肝胆系统清除(王世若等,1996)。因此,IgA对阻止日粮抗原入侵以及对已入侵的抗原予以清除具有重要作用。其它几种抗体与抗原形成的复合物则具有较强的药理作用。IgM或IgG与抗原形成的复合物一旦穿过肠壁进入循环则可刺激全身的淋巴结并产生较多的IgM或IgG。循环中的IgM/IgG-抗原复合物可沉积在肠壁组织内,通过激活补体系统释放出过敏毒素和血管通透性增强因子。同时,抗原-抗体复合物还可黏附于血小板上,促使活性胺的释放,或引起嗜中性粒细胞对其吞食,由嗜中性粒细胞释放出各种蛋白水解酶,引起组织损伤(即三型变态反应)。IgE的Fc片段可与组织中的肥大细胞上的Fc受体结合,使机体致敏。当日粮抗原再次进入机体后,抗原与结合在肥大细胞上的IgE结合而导致组胺快速释放(Ⅰ型变态反应),结果毛细血管渗透性增加,血浆蛋白漏入肠腔,出现肠黏膜水肿等。 

大豆抗原蛋白引起过敏反应造成的免疫损伤主要发生在肠道,包括上皮淋巴细胞增加、隐窝细胞有丝分裂速度加快、血浆蛋白漏入肠腔、杯状细胞黏液渗出以及肠绒毛结构变化。细胞免疫和体液免疫参加了这一过程,但绒毛结构的变化主要是由细胞免疫引起的,这种作用使小肠结构受损、食糜滞留时间缩短,营养物质转运和吸收出现紊乱,最终导致消化不良和腹泻(Lalles等,1993)。 

目前,由于受提纯方法的限制,很难获得大量、高纯度的大豆抗原蛋白样品,因此很少有试验以纯蛋白分子的glycinin或β-conglycinin为研究对象探讨其对畜禽的致敏机理,而更多的是集中于整个大豆蛋白的共同作用。因此,获得大量的纯品抗原蛋白具有极其重要的意义。在Thanh和Shibasak(1976)方法的基础上,游金明(2007)用免疫亲和层析、郭鹏飞(2007)用基因表达的方法分别获得了纯度大于93%和99%的β-conglycinin及其α'亚基。Guo等(2007a)随后以大鼠为实验动物建立了过敏反应模型,将体内与体外试验相结合,系统研究了β-conglycinin及其α'亚基对大鼠的致敏作用。结果发现,在灌服β-conglycinin及其α'亚基后,大鼠的IgE和IgG1抗体浓度显著升高(P<0.05),肠道中肥大细胞数量增加,肥大细胞脱粒现象明显;肠道组织中组胺的释放率和释放量增加;淋巴细胞过度增殖,CD4+显著升高,血液和脾脏中的IL-2、IL-4和IL-5的分泌量增加。在后来的研究中,Guo等(2007b)进一步证实了大豆β-conglycinin对大鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响。这些免疫反应最终引起小肠炎症及上皮细胞变性坏死,造成免疫功能和组织器官的损伤及消化吸收不良。 

4 加工处理对大豆抗原蛋白免疫原性的影响 

大豆glycinin、β-conglycinin是热稳定性的抗原蛋白,直接加热并不能彻底破坏其抗原活性。经过加热处理的大豆制品仍可引起断奶仔猪和犊牛的消化异常和肠道黏膜的炎症反应。与glycinin相比,β-conglycinin的热稳定性相对较差,因此,破坏速度相对较快。生大豆(CP 36.5%)中β-conglycinin的含量约为155 mg/g,烘烤大豆中含量为52 mg/g(Murphy和Resurreccion,1984),而经过乙醇浸提获得的大豆浓缩蛋白(Soy protein concentrate,SPC)中β-conglycinin的含量则降低至5 mg/g左右(Russett,1997)。另外,膨化大豆中虽然glycinin的含量仍然较高,但β-conglycinin的含量大为降低。经过适当加工处理后的大豆,虽然无法彻底破坏其抗原蛋白的活性,但可以在一定程度上减轻其对畜禽的致敏作用。Li等(1991)和谯仕彦等 (1995)对断奶仔猪试验的结果证实,经过膨化处理的豆粕能降低仔猪血清中抗glycinin、β-conglycinin抗体的滴度,并能降低glycinin、β-conglycinin引起的迟发型过敏反应程度。目前已证实,豆粕、膨化大豆、发酵豆粕、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白等大豆制品的抗原活性低于生大豆。但是,在大豆加工参数和抗原蛋白活性的致敏临界值方面还没有一个统一的认识,其原因主要是抗原蛋白活性的定量检测技术还很薄弱。已有的定量检测方法主要以抗血清测定和高效液相色谱分析为主。这些方法从免疫学角度来看仍存在一定的缺陷,前者检测的灵敏度较低,后者则无法体现免疫反应性,并且由于前处理过程繁琐和需要昂贵的专门仪器而难以广泛应用于大豆制品的现场检测。You等(2007)以β-conglycinin分子上的一段抗原表位肽为半抗原,与载体蛋白OVA交联后作为免疫原,成功制备了能够识别α与α'亚基的抗β-conglycinin单克隆抗体。以该抗体为基础建立的β-conglycinin定量ELISA方法应用于大豆制品的检测,检测限高达2.0 ng/ml。因此,抗β-conglycinin单克隆抗体的制备为β-conglycinin免疫原性的定量分析提供了一个有效工具,同时,为指导大豆的正确加工以减少或消除大豆抗原蛋白的免疫活性,提高大豆的利用效率奠定了基础。

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